NP/RP Chromatographie

NP = Normal Phasen Chromatographie (auch NP Modus genannt)
RP = Reversed Phasen Chromatographie (auch RP Modus genannt)

In den Anfängen der Chromatographie wurde als gängige stationäre Phase gebrochenes Silicagel (auch: Kieselgel) verwendet. Es konnte günstig hergestellt werden, war relativ inert und hatte ein grosse innere Oberfläche. Gebrochenes Silica wurde aus Sodium Silicat durch Hydrolyse und anschliessende Trocknung hergestellt. Die Verteilung der Partikelgrösse bewegte sich zwischen 10 - 30 µm.

In den frühen 70er Jahren wurde die Herstellung von sphärischem Silica entdeckt. Durch die runde Form des spärischen Silica konnten die Säulen besser gepackt werden, da sich die Partikel schöner ineinander plazieren liessen, was einen regelmässigeren Fluss der mobilen Phase ermöglichte. Auch die Grössenverteilung der Partikel konnte genauer festgelegt werden. Es konnten Partikelgrössen von 5 µm und 3 µm produziert werden. Dies beeinflusste die Effizienz der Säule positiv erhöhte aber den Rückdruck.

Ebenfalls zu Beginn der 70er Jahre tauchten gebundene Phasen auf. Das heisst, das polare Silica wurde mit unpolaren Molekülen belegt (gebunden) - siehe Reversed Phasen Chromatographie.

Man unterscheidet zwischen Normal Phasen- und Reversed Phasen Chromatographie

In der Normal Phasen Chromatographie (NP) wird zur Trennung eine polare stationäre Phase (z. Bsp. Silicagele) eingesetzt. Mit steigender Polarität der mobilen Phase nimmt auch die Elutionskraft zu, d. h. die Elution einer Substanz erfolgt je nach Polarität schneller oder langsamer. Unpolare Moleküle verlassen die Säule schneller als polare Moleküle, welche auf der Säule länger zurückgehalten werden.

In der Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) werden analog zur NP Selektivität polare stationäre Phasen verwendet, aber mit Puffersystemen die identisch zur RP Chromatographie sind, das heisst wässrige Puffersysteme mit organischem Modifier, bevorzugt Acetonitril.

In der Reversed Phase Chromatographie (RP) ist die stationäre Phase unpolar. Zur Herstellung der unpolaren stationären Phase lässt man Silane, die mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel ragieren. Die polare Oberfläche der Silicagels wird mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen. Die Polarität der Phase wird also umgekehrt (engl. reversed). Im Gegensatz zur NP sinkt die Elutionskraft mit steigender Polarität. Als mobile Phase werden meist polare Mischungen eingesetzt, also z. Bsp. Wasser und Acetonitril.

Für die isokratische Trennung wird die Zusammensetzung der Mobilen Phase während der Trennung nicht verändert.

Bei Gradiententrennung wird die Mobile Phase im Verlauf der Trennung in ihrer Zusammensetzung verändert. Diese Art der Trennung ist heute die gängigste Methode.

UHPLC mit Fused Core Technologie: HALO Säulen haben eine RP Phase. Durch die Fused Core Technologie, bei der eine poröse Schicht auf einen soliden Silikakern "aufgeschweisst wird, erlaubt die HALO Phase die schnelle Trennungen wie in der UPLC, doch bei "normalem" Druck unter 400 bar und mit herkömmlichen HPLC Anlagen.

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